2024年11月，南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系魯明教授、胡剛教授團(tuán)隊(duì)在Cell Death & Differentiation發(fā)表題為”Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons”的研究論文，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述小鼠硬腦膜免疫細(xì)胞的抗抑郁機(jī)制，為抑郁癥治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。接下來是本文的詳細(xì)解讀。

文章標(biāo)題：Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons

期刊名稱：?Cell Death & Differentiation

影響因子：13.7

合作單位：南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系

研究對象：小鼠

百邁客生物為該研究提供了10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

抑郁癥是一種常見的精神障礙，表現(xiàn)為長時(shí)間情緒低落、失去快樂或?qū)顒拥呐d趣等，其表現(xiàn)不同于正常的情緒變化和對日常生活的感覺。抑郁癥具有發(fā)病率高、臨床治愈率也高，但治療接受率低、復(fù)發(fā)率高的特征，目前治療手段有限，約有30%患者接受一線抗抑郁藥物后癥狀無緩解，癥狀有緩解的部分患者會在首次治療后復(fù)發(fā)。因此，有必要深入研究認(rèn)識抑郁癥的生理病理致病機(jī)制，為開發(fā)更有效的治療手段提供見解。

材料及方法

材料：8周大C57BL/6雄性小鼠以及6個(gè)月大ICR小鼠，構(gòu)建慢性社交挫敗應(yīng)激（CSDS）模型。不同基因型小鼠（Il33-/-，Il1rl1-/-，Rag1-/-，F(xiàn)oxp3DTR）購買后，培養(yǎng)1周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，免疫熒光，RT-PCR，ELISA，Western blot，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，動物實(shí)驗(yàn)等。

研究結(jié)果

• 抑郁應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)顯著的硬腦膜Treg擴(kuò)增

研究者首先構(gòu)建CSDS小鼠模型并經(jīng)過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用流式細(xì)胞術(shù)等研究CSDS小鼠硬腦膜-腦界面免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Treg（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）在硬腦膜而不是腦實(shí)質(zhì)中顯著增殖激活，fluoxetine（抗抑郁藥物）顯著激活硬腦膜Treg擴(kuò)增，這些結(jié)果暗示Treg可能在抑郁樣行為發(fā)展中起到重要作用，fluoxetine可能通過增加硬腦膜中的Treg減輕抑郁表現(xiàn)，調(diào)控硬腦膜Treg或許是治療抑郁的潛在靶點(diǎn)。

• 定義硬腦膜Treg免疫表型

CSDS小鼠和對照組小鼠硬腦膜分選得到的免疫細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，結(jié)果顯示CSDS小鼠硬腦膜T細(xì)胞占比增加，其中Treg和Th17比例增加，Th2比例降低，初始T細(xì)胞沒有發(fā)生變化；Treg中，Gata3+?Treg比例提高，初始Treg和Rorx+?Treg比例降低。對照組小鼠硬腦膜和脾臟分選得到Treg進(jìn)行SMART-seq，發(fā)現(xiàn)與脾臟相比，硬腦膜Treg的Gata3+亞型和Rora+亞型相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)CSDS小鼠硬腦膜中GATA3+?Treg顯著增加，RORγt+?Treg數(shù)量無顯著變化。這些表明GATA3+ Treg可能參與抑郁表現(xiàn)的調(diào)控。

• IL33/ST2信號參與CSDS應(yīng)激后硬腦膜中Treg增加

SMART-seq數(shù)據(jù)顯示CSDS小鼠硬腦膜“IL33結(jié)合”以及其他內(nèi)源性分子結(jié)合信號通路表達(dá)上調(diào)；與脾臟相比，CSDS小鼠硬腦膜中表達(dá)ST2的細(xì)胞比例顯著高于脾臟；硬腦膜Treg富集趨化性通路。scRNA-seq數(shù)據(jù)也顯示CSDS小鼠模型中T淋巴細(xì)胞聚群高表達(dá)ST2編碼基因，且表達(dá)水平高于對照組小鼠的T淋巴細(xì)胞；CSDS小鼠模型硬腦膜Treg高表達(dá)ST2編碼基因。隨后，研究者將WT小鼠和Il1rl1-/-小鼠硬腦膜Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag1-/-小鼠并構(gòu)建CSDS模型，行為學(xué)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ST2表達(dá)是硬腦膜Treg招募和擴(kuò)張所必須的。IL33-/-小鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)也支持了IL33/ST2信號在抑郁期間促進(jìn)硬腦膜Treg增殖。

• mPFC星形細(xì)胞IL33介導(dǎo)了硬腦膜Treg的浸潤

mPFC、海馬、腦脊液等組織的ELISA、qPCR以及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSDS小鼠硬腦膜ST2+ Treg激活所需的IL33來源于腦實(shí)質(zhì)而不是硬腦膜。多重免疫熒光結(jié)果表明mPFC處星形細(xì)胞是IL33增加的主要貢獻(xiàn)細(xì)胞類型。進(jìn)一步的特異性細(xì)胞類型IL33基因表達(dá)KO-恢復(fù)實(shí)驗(yàn)及相應(yīng)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等結(jié)果表明，主要是星形細(xì)胞來源的IL33介導(dǎo)了CSDS小鼠中硬腦膜Treg的產(chǎn)生。

• 通過增強(qiáng)AREG分泌，硬腦膜Treg抵消了抑郁應(yīng)激

進(jìn)一步分析scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞簇還顯著高表達(dá)Areg，流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)表明CSDS小鼠硬腦膜AREG分泌加強(qiáng)，mPFC區(qū)域AREG表達(dá)水平顯著降低。通過向CSDS應(yīng)激小鼠腦延髓注釋AREG的中和抗體并進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CSDS小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的抑郁行為。這些結(jié)果暗示來源于硬腦膜Treg的AREG可能是抑郁進(jìn)展中的主要中間物。

• 硬腦膜Treg來源的AREG可以影響CSDS小鼠mPFC的錐體神經(jīng)元

腦免疫熒光掃描結(jié)果表明硬腦膜來源的AREG可能特異性的影響mPFC神經(jīng)元活性，TSA多重染色等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSDS應(yīng)激顯著誘導(dǎo)mPFC神經(jīng)元EGFR（AREG是EGFR配體）的表達(dá)，硬腦膜AREG去除可顯著抑制mPFC的EGFR激活，小腦延髓池注射的AREG中和抗體只去除了硬腦膜AREG但對mPFC腦區(qū)AREG無顯著影響。通過這些結(jié)果，研究者假設(shè)神經(jīng)元表達(dá)EGFR可以接收硬腦膜Treg來源的AREG，并激活EGFR信號，直接影響神經(jīng)元活性。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者使用AAV抑制mPFC錐體神經(jīng)元EGFR的表達(dá)，免疫熒光、Western blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除EGFR部分地加重CSDS小鼠抑郁表現(xiàn)，應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁中mPFC神經(jīng)元EGFR信號起到重要作用，揭示mPFC錐體神經(jīng)元是硬腦膜Treg來源AREG的靶細(xì)胞。

隨后研究者使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄CSDS小鼠mPFC錐體神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流（mEPSC），發(fā)現(xiàn)20ng/ml AREG條件下，錐體神經(jīng)元的mEPSC振幅顯著降低但頻率沒有變化，表明AREG可抑制AMPA受體功能，降低突觸后位點(diǎn)數(shù)量，進(jìn)一步降低EGFR+ 錐體神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞。

綜上，研究者推測硬抑郁小鼠腦膜Treg來源的AREG可以通過抑制mPFC錐體神經(jīng)元的過度興奮，抵抗抑郁表現(xiàn)。

研究總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)硬腦膜Treg在神經(jīng)響應(yīng)抑郁刺激中起到重要作用，硬腦膜Treg與mPFC神經(jīng)細(xì)胞通過AREG-EGFR交流，調(diào)控抑郁進(jìn)展。該發(fā)現(xiàn)表明硬腦膜Treg可作為減輕抑郁表型的靶點(diǎn)，為開發(fā)新型診療手段提供了不同思路。