2025年3月5日，貴州大學(xué)王孝敬、牛素貞和華北理工大學(xué)宋小明等在iMeta在線發(fā)表了題為“T2T genome, pan-genome analysis, and heat stress response genes in Rhododendron?species”的文章。該研究首次報(bào)道了T2T水平的百合杜鵑基因組，鑒定了幾個(gè)與熱脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因和miRNA，為杜鵑屬植物的比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究提供了豐富的資源。

文章題目：T2T?genome,?pan-genome?analysis?and?heat?stress response?genes?in?Rhododendron?species

發(fā)表期刊：iMeta

影響因子：23.8

合作單位：貴州大學(xué)，華北理工大學(xué)

百邁客生物為此項(xiàng)研究提供基因組測(cè)序及部分分析服務(wù)。

研究亮點(diǎn)：

① 該研究首次報(bào)道了具有13條染色體的高質(zhì)量端粒到端粒（T2T）的百合杜鵑基因組；

② 基于15個(gè)杜鵑屬植物基因組，對(duì)杜鵑屬植物進(jìn)行了泛基因組分析；

③ 結(jié)合基因組測(cè)序和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定了幾個(gè)與熱脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因和miRNA，為杜鵑屬植物的比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究提供了豐富的資源。

研究背景

杜鵑花屬于杜鵑花科，是木本植物中最大的屬之一。全世界大約有1000種杜鵑花，中國(guó)是重要的分布中心。它們?cè)谙柴R拉雅-橫斷山脈經(jīng)歷了進(jìn)化輻射，橫斷山脈是世界生物多樣性的熱點(diǎn)。杜鵑花屬植物因其觀賞價(jià)值而在園藝中占有重要地位。全球氣候變化導(dǎo)致溫度升高，而熱脅迫會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。然而，杜鵑花植物通常適應(yīng)較冷的氣候。利用多組學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)研究杜鵑花對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)選育耐熱品種、擴(kuò)大杜鵑花栽培范圍具有重要意義。

材料及方法

T2T基因組組裝：Rhododendron liliiflorum

泛基因組分析：4個(gè)本次組裝的基因組+11個(gè)已報(bào)到的杜鵑屬基因組

全轉(zhuǎn)錄組：CK熱處理、熱處理3天（H3）和6天（H6）條件下進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

兩對(duì)具有代表性的miRNAs和相關(guān)靶基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

研究結(jié)果

1.杜鵑屬植物基因組測(cè)序、組裝與評(píng)價(jià)

該研究通過(guò)PacBio HiFi、Oxford Nanopore Technology（ONT）、Illumina和Hi-C技術(shù)（圖1A，表S1-6）對(duì)四種杜鵑花植物（Rhododendron liliiflorum、Rhododendron decorum、Rhododendron platypodum和Rhododendron concinnum）進(jìn)行從頭基因組測(cè)序。通過(guò)K-mer估算的R. liliiflorum、R. decorum、R. platypodum和R. concinnum的基因組大小分別為759.08 Mb、581.05 Mb、593.47 Mb和1356.22 Mb，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證（表S1，圖1B）。

作者發(fā)現(xiàn)，R. concinnum的基因組幾乎是其他三個(gè)物種的兩倍大。因此，作者們利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析了染色體核型，首次發(fā)現(xiàn)R. concinnum為四倍體，核型為2n=4x=52，與其他三個(gè)二倍體物種（2n=2x=26）有明顯差異（圖1C，表S1）。

4個(gè)物種的基因組大小分別為793.25 Mb、649.87 Mb、652.27 Mb和1321.11 Mb（表S1）。經(jīng)Hi-C檢測(cè)，4個(gè)種的染色體錨定率均在97.90%以上（圖1D，表S5）。作者獲得了4個(gè)高質(zhì)量的組裝基因組，支架N50大于48.68 Mb。核心真核基因作圖法（CEGMA）值從95.63%到99.56%，基準(zhǔn)通用單拷貝同源序列（BUSCO）值從96.65%到97.34%，讀取作圖率超過(guò)99.40%（表S7）。

最重要的是，作者獲得了一個(gè)高質(zhì)量的R. liliiflorumT2T基因組，該基因組由13條染色體組成，檢測(cè)到24個(gè)端粒和13個(gè)著絲粒（圖S1A，表S8-11）。其中11條染色體在端粒與端粒之間沒(méi)有間隙，另外2條染色體只有一個(gè)間隙。百合杜鵑花基因組的重疊群N50大于58.56MB，大于以往大多數(shù)杜鵑基因組的重疊群N50。采用BUSCO軟件對(duì)基因組完整性進(jìn)行評(píng)估（96.65%），基因組一致性質(zhì)量值（QV）為43.71（表S1）?；蚪MLTR組裝指數(shù)（LAI）值為21.15（圖S1B），表明已達(dá)到最高質(zhì)量水平（LAI≥20）。

重復(fù)序列占4個(gè)基因組的49.10%以上，以長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTRs）最多（圖1E，表S11）。在這四個(gè)基因組中，共預(yù)測(cè)到41406、41084、40556和83203個(gè)基因（表S12）。檢測(cè)到超過(guò)97.15%的BUSCO基因，說(shuō)明預(yù)測(cè)的完整性較高（表S13）。NR、eggNOG、GO、KEGG、TrEMBL、KOG、Swissprot和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)92.16%以上的基因進(jìn)行了注釋?zhuān)ū鞸14）。共檢測(cè)到2355、4862、2852和9511個(gè)非編碼RNA（表S15）。

2.15個(gè)杜鵑屬植物泛基因組分析

杜鵑屬植物以其多樣的花朵展示而聞名，近年來(lái)，隨著第一個(gè)R. delavayi基因組的公布，一些基因組被解碼，引起了科學(xué)界的高度關(guān)注。報(bào)道了幾種杜鵑屬植物的基因組，如R. griersonianum、R. Henanense、R. Irroratum、R. kiyosumense、R. Ripense、R. Vialii、R. nivale和R. williamsianum。這些基因組為泛基因組研究奠定了基礎(chǔ)?；谶@四個(gè)高質(zhì)量基因組以及11個(gè)先前發(fā)表的基因組，對(duì)杜鵑屬植物進(jìn)行了泛基因組分析（圖1F，表S16）。選擇T2T水平的R. liliiflorum基因組作為參考。該泛基因組通過(guò)添加394.57?Mb和14424個(gè)基因，擴(kuò)展了T2T水平的R. liliiflorum基因組。15個(gè)物種的基因家族數(shù)量為45731個(gè)，包括5734個(gè)核心基因家族、37027個(gè)可有可無(wú)的基因家族和2970個(gè)私有基因家族（圖1G、圖S2A、表S17）。利用打亂圖分析了15個(gè)物種間基因家族共享與唯一性的關(guān)系。最后，作者基于聚類(lèi)分析構(gòu)建了基因家族存在與否的分布圖（圖1H）。在2970個(gè)私有基因家族中，R.irroratum（1705）的物種特異性基因最多（表S17，圖S2B）。功能富集分析表明，“倍半萜和三萜生物合成”和“亞油酸代謝”途徑顯著富集（圖S3）。共鑒定出121185個(gè)核心基因，R. ovatum基因組的數(shù)量最多（9847）（圖S2B）。功能富集分析表明，與花的顏色和香味相關(guān)的基因途徑顯著富集，如檸檬烯和蒎烯降解（圖S4）。

3.15個(gè)杜鵑屬植物基因組的變異分析

基于以T2T基因組為參考的泛基因組分析，作者對(duì)杜鵑花的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、插入和缺失（InDels）以及結(jié)構(gòu)變異（SVs）等變異進(jìn)行了全面鑒定（圖1I-L，圖S5）。四倍體R. concinnum具有最多的SNP（1876446）和InDels（447281）（圖1I，表S18-19）。功能富集分析表明，含有SNPs和InDels的基因在“碳代謝”和“氨基酸生物合成”途徑中顯著富集。R. concinnum的SV數(shù)量最多，達(dá)到7694（表S20）。同時(shí)，作者進(jìn)一步將SVs細(xì)分為重復(fù)（DUP）、易位（TRANS）和反轉(zhuǎn)（INV），發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)杜鵑屬植物中，前者的數(shù)量超過(guò)后者（圖S6-7）。SVs基因與SNPs或InDels基因相比表現(xiàn)出明顯的模式，主要集中在RNA聚合酶和mRNA監(jiān)控途徑上。

4.15個(gè)杜鵑花基因組的LTR分析

該研究在15個(gè)杜鵑屬物種的全基因組中鑒定了70759個(gè)LTR，其中R. griersonianum基因組的LTR數(shù)量最多（7323）（表S21）。作者發(fā)現(xiàn)，在過(guò)去的一百萬(wàn)年中，大多數(shù)杜鵑花物種只經(jīng)歷了一次插入事件的爆發(fā)，而R. delavayi、R. molle和R. williamsianum經(jīng)歷了兩次插入事件的爆發(fā)。兩個(gè)事件分別發(fā)生在1.53mya和2.94mya。作者對(duì)15個(gè)物種的LTR進(jìn)行聚類(lèi)，得到每個(gè)聚類(lèi)中的共享LTR。結(jié)果表明，共有2622個(gè)LTR聚類(lèi)，其中R. platypodum最多（531個(gè)）。R. liliiflorum中特異性LTRs數(shù)量最多（109個(gè)），而R. williamsianum中未發(fā)現(xiàn)物種特異性LTRs。聚類(lèi)圖顯示，R.williamsianum與其他物種共享LTR的比例最高（圖1M）。此外，LTR在染色體中部的分布密度大于兩端（圖1N）。

5.15個(gè)杜鵑屬植物基因組的共線性分析

通過(guò)共線性分析，研究發(fā)現(xiàn)15個(gè)杜鵑基因組普遍表現(xiàn)出良好的共線性（圖1O）。共線性區(qū)組數(shù)從336個(gè)（R. henanense?vs?R. delavayi）到692個(gè)（R. irroratum?vs?R. prattii）。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些基因組轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，如R. ovatum7號(hào)染色體的末端區(qū)域與R. simsii和R. henanense。

6.熱反應(yīng)基因的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與檢測(cè)

為了探索杜鵑花的耐熱基因和調(diào)控機(jī)制，該研究在CK熱處理、3天熱處理（H3）和6天熱處理（H6）條件下進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖2A，表S22）。共鑒定出50648個(gè)mRNAs、17476個(gè)lncRNAs、448個(gè)miRNAs和6299個(gè)circRNAs（圖2B）。此外，在CK、H3和H6處理中，632個(gè)mRNAs、21個(gè)lncRNAs和6個(gè)miRNAs的表達(dá)和共享存在差異（圖2C）。

7.候選基因的功能驗(yàn)證

該研究選擇了兩對(duì)具有代表性的miRNAs和相關(guān)靶基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。熱處理后3h和6h，靶基因表達(dá)顯著上調(diào)，小RNA表達(dá)顯著下調(diào)。作者進(jìn)一步研究了miR177對(duì)RdbHLH153（Rhdel02G0118700）表達(dá)和miR49對(duì)RdMYB1R1（Rhdel08G0208700）表達(dá)的影響。將螢火蟲(chóng)熒光素酶分別融合到RdbHLH153和RdMYB1R1的C端，并將miR49和miR177分別插入SK載體（圖2D）。結(jié)果顯示，RdbHLH153中的miR177和RdMYB1R1中的miR49的靶位點(diǎn)略有改變（圖2E）。用RdbHLH153/RdMYB1R1與空SK載體（混合并滲透）或RdbHLH153與miR177（RdMYB1R1和miR49）的混合物對(duì)煙草單葉滲透區(qū)進(jìn)行滲透。均顯示熒光素酶信號(hào)的誘導(dǎo)，而R. delavayi中過(guò)表達(dá)的miR177和miR49可消除RdbHLH153/RdMYB1R1產(chǎn)生的信號(hào)（圖2E-G）。

為了進(jìn)一步研究RdbHLH153和RdMYB1R1在熱脅迫中的作用，采用花浸法獲得了過(guò)表達(dá)RdbHLH153和RdMYB1R1的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（表S23）。36 h熱處理后，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于WT（圖2H）。經(jīng)過(guò)熱處理后，幼苗恢復(fù)正常狀態(tài)5天，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)活，WT葉片全部變黃。說(shuō)明RdbHLH153和RdMYB1R1在提高耐熱性中起重要作用。DAB和NBT染色顯示，與野生型植株相比，RdbHLH153/RdMYB1R1 OE株系中H2O2和O?2的含量顯著降低（圖2I）。

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