2024年5月9日，韶關(guān)學(xué)院和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在國際學(xué)術(shù)期刊?Postharvest Biology and Technology?發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning。該研究通過植物廣靶代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析研究了芋頭片在冷藏過程中的褐變發(fā)展及潛在的褐變機(jī)制。這項(xiàng)研究有助于我們了解鮮切食品的褐變機(jī)制，為未來的研究和減輕冷藏條件下切片芋頭褐變的潛在策略提供寶貴的見解。

文章標(biāo)題：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning

期刊名稱：Postharvest Biology and Technology

影響因子：7.0

合作單位：韶關(guān)學(xué)院和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

研究對象：芋頭

研究方法：生理、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等

百邁客生物為該研究提供了植物廣靶、轉(zhuǎn)錄組測序和分析服務(wù)。

研究背景

在飲食中加入更多的新鮮蔬菜可以帶來許多健康益處，包括降低對慢性疾病的易感性和減緩衰老過程。市場上根莖類蔬菜切根產(chǎn)品的保質(zhì)期短，破壞了這些優(yōu)勢。切面褐變是限制切片蔬菜產(chǎn)品壽命的主要因素之一。因此，了解切片產(chǎn)品褐變背后的機(jī)制對于開發(fā)創(chuàng)新技術(shù)至關(guān)重要，這些技術(shù)可以在儲(chǔ)存和消費(fèi)過程中有效地保持這些產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和整體質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用購自中國韶關(guān)的“冰瑯玉”品種(Colocasia esculenta)。用于調(diào)查的芋頭大小相似，從大約800克到1000克不等，沒有任何明顯的缺陷或機(jī)械損傷。這些選定的芋頭被迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，為了確保清潔，在削皮和切割之前，要用自來水沖洗掉芋頭球莖表面殘留的淤泥。然后，將芋頭削皮，切成約1厘米厚的薄片作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。首先用次氯酸鈉溶液(0.1 g/L)對芋頭切片進(jìn)行滅菌。隨后，將無菌芋頭片密封在聚乙烯袋中(0.02 mm厚，尺寸為20 × 30 cm) (Xiao et al, 2020)。最后，芋頭切片冷藏(4℃)， RH為90-95%，持續(xù)12天。樣品每隔2天采集一次，用于后續(xù)分析。在第0天(C0)、第6天(C6)和第12天(C12)獲得的樣本用于植物廣靶代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

研究結(jié)果

1.生理分析——冷庫條件下芋頭片褐變評價(jià)

芋片切面顏色隨貯藏時(shí)間的變化如圖1A所示。切面L*值從0 d時(shí)的88.72下降到12 d時(shí)的80.36，冷藏12 d后L*值下降了9%(圖1A)。芋頭切片表面的a*、b*、△E和BI值在冷藏過程中也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(圖1B-E)。這些褐變指標(biāo)隨著貯藏時(shí)間的延長而增加。冷藏12 d后，a*、b*、△E和BI值分別比0 d增加了582%、58%、725%和19%(圖1B-E)。宏觀褐變癥狀在第6天首次出現(xiàn)，并在隨后的儲(chǔ)存過程中逐漸加劇(圖1F)。綜上所述，這些結(jié)果表明，即使在低溫(4℃)條件下，切片芋頭在儲(chǔ)存過程中也會(huì)發(fā)生褐變。

為了闡明切片芋頭褐變的機(jī)制，研究人員分別在第0天、第6天和第12天對芋頭樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。

2.代謝組分析——切片芋頭褐變過程代謝組學(xué)分析

為了比較芋頭切片褐變過程中三個(gè)階段代謝物組成的差異，研究通過植物廣靶代謝組學(xué)分析，總共成功鑒定了芋頭切片中的638種代謝物。PCA分析顯示，三個(gè)儲(chǔ)存點(diǎn)采集的芋頭樣品具有明顯的分離性(圖2A)。在C0 vs C6中，共鑒定出206個(gè)DAMs，其中99個(gè)DAMs的豐度增加，107個(gè)DAMs的豐度減少。C6 vs C12共197個(gè)DAMs，分別有84個(gè)DAMs豐度增加，113個(gè)DAMs豐度減少。C0 vs C12包括119個(gè)DAMs，分別有51個(gè)DAMs和68個(gè)DAMs顯示豐度增加和減少(圖2B)。這些結(jié)果表明，在褐變過程中，代謝物豐度的減少幅度更大。

韋恩圖分析評估每個(gè)差異分組特有和共有的DAMs (圖2C)。圖2D-F展示了每個(gè)比較組中豐度增加和減少的top20的DAMs。C6組中10個(gè)代謝物豐度升高，如2′-脫氧腺苷、3-O-對香豆?？鼘幩帷 -乙酰- l -蘇氨酸、松柏醛、9(10)-EpOME、6-O-咖啡酰丁醇、表肌醇、l -同型半胱氨酸、5-O-對香豆?？鼘幩帷愂罄钏?。相反，琥珀酸酐、9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、氨基丙酸、N6-(2-羥乙基)腺苷、2-(二甲氨基)鳥苷、芐基-(2 ‘-O-木糖基)葡萄糖苷、鳥苷、肌苷、D-甘露糖和肌苷5 ‘ -單磷酸在C6組中的豐度較低(圖2D)。

在C6和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- l-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、松木醛、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O-葡萄糖苷、6- O -對咖啡?；芄啊?-O-對香豆?；鼘幩?、異鼠李素、反式- 4-羥基肉桂酸甲酯和3- O -對香豆?；鼘幩嵩贑12組中表現(xiàn)出更高的富集度。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、酪氨酸、S-Aiiyl-L-半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C6組中具有更高的豐度(圖2E)。

在C0和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- L-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、5- O -對香豆?；鼘幩?、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O -糖苷、松木醛、6- O -對咖啡?；芄?、異鼠李素、3-O-對香豆?；鼘幩岷头词?4-羥基肉桂酸甲酯在C12組中含量較高。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、肌苷、S – aiiyl -L -半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C0組中表現(xiàn)出更高的豐度(圖2F)。

3.代謝組分析——切片芋頭褐變過程中DAMs的積累模式

為進(jìn)一步分析代謝物在9個(gè)樣本的積累模式，該研究進(jìn)行了聚類熱圖分析。結(jié)果顯示，隨著貯藏時(shí)間的延長，褐變程度逐漸增加，推測持續(xù)增加的DAMs可能有助于切片芋頭的褐變或促進(jìn)其褐變過程。因此，該研究關(guān)注分析在褐變過程中豐度持續(xù)上升的DAMs (圖3B-L)。確定了11個(gè)DAMs在褐變過程中豐度持續(xù)增加，如2-α-亞麻烯酰甘油、甘油亞油酸、(9Z,11E)-十八烯二烯酸、N-油基乙醇胺、γ-亞麻酸、1-亞麻油基甘油、2-亞麻油基甘油、N-α-乙?；? L-鳥氨酸、α-亞麻酸、9-羥基-10、12-十八烯二烯酸和1-α-亞麻烯酰甘油。值得注意的是，在這11個(gè)DAMs中，有10個(gè)是脂肪酸或脂質(zhì)衍生物。幾種褐變指標(biāo)與這些水DAMs之間的相關(guān)系數(shù)非常高。這些結(jié)果表明，在切片芋頭中脂質(zhì)代謝與褐變發(fā)展之間存在潛在的聯(lián)系。

4.轉(zhuǎn)錄組分析——冷藏芋頭切片褐變過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

為了更好地了解基因表達(dá)的變化，該研究進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示許多基因在芋褐變過程中表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜。具體來說，在C0和C6的比較中，鑒定出3103個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和1685個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。同樣，在C6和C12組的比較中，發(fā)現(xiàn)3021個(gè)DEGs上調(diào)，2350個(gè)DEGs下調(diào)。此外，與C0組相比，C12組有5108個(gè)基因的表達(dá)量更高(圖4A)。在褐變過程中發(fā)現(xiàn)了更多的上調(diào)基因，表明芋頭的基因表達(dá)發(fā)生顯著的變化。有趣的是，當(dāng)比較C0與C6、C6與C12、C0與C12之間的DEGs時(shí)，發(fā)現(xiàn)1396個(gè)DEGs重疊(圖4B)。

根據(jù)褐變過程中的表達(dá)模式，將DEGs分為6個(gè)簇。每個(gè)聚類(從1到6)分別由1607、1293、533、1741、634和2470個(gè)度組成(圖4C)。KEGG富集分析顯示，簇1中有四個(gè)途徑的DEGs顯著富集:α-亞麻酸代謝、生物素代謝、植物-病原體相互作用以及淀粉和蔗糖代謝(圖4D)。此外，集群2中的DEGs在α-亞麻酸代謝、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成途徑中富集(圖4E)。

5.聯(lián)合分析——基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究脂質(zhì)代謝與冷藏芋頭切片褐變之間的關(guān)系，研究采用WGCNA分析進(jìn)行研究。如圖5A所示，鑒定出兩個(gè)與切片芋頭在冷藏期間褐變發(fā)育顯著相關(guān)的模塊。藍(lán)色模塊中基因與褐變BI、a*、b*、△E 4項(xiàng)指標(biāo)呈正相關(guān)，而綠松石模塊中基因與褐變指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)(圖5B)。此外，隨著褐變的發(fā)展，藍(lán)色模塊中基因的表達(dá)量逐漸增加，而綠松石模塊中基因的表達(dá)量逐漸減少(圖5C)。此外，藍(lán)色和綠松石模塊中每個(gè)基因與褐變的相關(guān)性都很高(圖5D)，說明這兩個(gè)模塊的基因與冷藏芋頭片的褐變發(fā)育高度相關(guān)。

切片芋頭的褐變與藍(lán)色模塊中的基因正相關(guān)，對該模塊中的基因進(jìn)行了KEGG富集分析。在top20個(gè)富集的KEGG通路中，泛素介導(dǎo)的蛋白水解、α-亞麻酸代謝和谷胱甘肽代謝是富集最顯著的通路。尤其是α-亞麻酸代謝途徑和甘油脂代謝途徑中分別富集了14個(gè)和18個(gè)基因(圖5E)。這些結(jié)果為脂質(zhì)代謝參與切片芋頭褐變的事實(shí)提供了進(jìn)一步的線索。

6.基因驗(yàn)證——參與亞麻酸代謝的DEGs的表達(dá)模式

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量，研究檢測了亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達(dá)模式。在切片芋頭褐變過程中，該途徑中的DEGs差異表達(dá)(圖6A)。在這些基因中，4個(gè)基因(taro_028466、029177、001379和new gene_1582)的表達(dá)量在第6天較0天下降(圖6A)。10個(gè)基因(taro_026230、017933、007794、026197、032526、040173、011856、050352以及new gene_27424和3563)的表達(dá)量在第6天出現(xiàn)了增加，隨后又出現(xiàn)了下降。然而，這些基因在第12天的表達(dá)水平仍然高于第0天(圖6A)。其余15個(gè)基因在褐變過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)增加。這些結(jié)果再次證實(shí)了亞麻酸代謝參與了芋頭褐變過程。

作者選擇了5個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析(圖6B-F)。隨著貯藏時(shí)間的延長或褐變程度的惡化，這5個(gè)基因的表達(dá)量均呈上升趨勢。此外，通過RNA-seq和qRT-PCR分析確定的這些基因的總體表達(dá)模式高度一致(圖6B-F)，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。

7.基因驗(yàn)證——在褐變過程中，膜脂過氧化作用加劇

上述結(jié)果表明，膜脂代謝可能在芋頭褐變過程中起一定作用。為了進(jìn)一步研究，評估了參與膜脂過氧化的關(guān)鍵DEGs的表達(dá)譜，如脂肪酶(LIP)和脂氧合酶(LOX)。三個(gè)差異表達(dá)的LIP基因在褐變過程中表達(dá)持續(xù)增加。LOX基因，除了8個(gè)LOX基因在褐變過程中逐漸增加，其他基因在褐變過程中表達(dá)先增加后下降 (圖7a)。這些結(jié)果表明，新鮮切割操作(如剝皮和切割)激活了芋頭的脂質(zhì)過氧化過程。

丙二醛通常被認(rèn)為是植物脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物。為了監(jiān)測切片芋頭褐變過程中膜脂過氧化情況，測定了LOX活性和MDA含量。隨著時(shí)間的推移，LOX活性和MDA含量隨著褐變繼續(xù)進(jìn)行逐漸升高 (圖7B, C)。這些結(jié)果表明，在褐變過程中，膜脂過氧化加劇。此外，相關(guān)分析顯示，LOX活性、MDA含量和其他褐變指標(biāo)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性?(圖7D)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了膜脂過氧化和/或代謝參與芋頭褐變。

研究總結(jié)

切面褐變的發(fā)生是鮮切行業(yè)中切片芋頭生產(chǎn)和商業(yè)化的一個(gè)重要障礙。代謝組學(xué)分析顯示，在芋頭褐變過程中，亞麻酸及其衍生物以及氫過氧化物的含量增加，表明發(fā)生了膜脂降解。RNA-seq分析顯示，參與褐變過程的DEGs富集于α-亞麻酸代謝途徑。WGCNA分析得到了兩個(gè)與芋頭褐變密切相關(guān)的模塊，其中藍(lán)色模塊的基因與BI呈正相關(guān)，強(qiáng)化了膜脂代謝與芋頭褐變之間的聯(lián)系。隨著芋頭褐變的進(jìn)行，LOX基因的表達(dá)和蛋白活性以及MDA的水平增加，表明膜脂過氧化促進(jìn)了切片芋頭褐變?？傊撗芯拷Y(jié)果強(qiáng)調(diào)了膜脂代謝在切片芋頭褐變中的重要性。這項(xiàng)研究通過轉(zhuǎn)錄組和植物廣靶代謝組分析全面研究了芋頭褐變的機(jī)制。