三、實驗流程

實驗結(jié)果

一、?cSCC的多模式分析

對10例患者手術(shù)切除的腫瘤和原位正常皮膚進行scRNA-seq（圖1A），共獲得48164個單細(xì)胞數(shù)據(jù)。通過無監(jiān)督聚類分析確定了腫瘤、正常上皮細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞亞型(圖1B)，并且對骨髓細(xì)胞亞群和NK&T細(xì)胞亞群進行了細(xì)分(圖1C&D)，所有的亞群都與之前的實體瘤scRNA-seq研究相似。細(xì)胞類型的比例分析也反映了細(xì)胞處理的一致性(圖1E&F)。本研究為cSCC提供了代表性的細(xì)胞圖譜。

圖1|正常皮膚和鱗狀細(xì)胞癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

二、?TSK細(xì)胞亞群

重新聚類正常上皮細(xì)胞后，在正常皮膚中觀察到3個主要的角質(zhì)細(xì)胞（KC）亞群（基底、循環(huán)、分化細(xì)胞）。典型相關(guān)分析表明腫瘤KCs廣泛重現(xiàn)了正常(基底、循環(huán)、分化細(xì)胞)亞群，在正常皮膚和cSCC中有幾個共享的標(biāo)記基因(圖2A-D)。有趣的是，在腫瘤細(xì)胞聚類中出現(xiàn)了與正常皮膚無明顯關(guān)聯(lián)的第四個KC亞群，即TSK亞群(圖2B-D)。事實上，在這一簇與其他腫瘤細(xì)胞區(qū)別開來的100個基因中，有99個基因在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織。TSK標(biāo)記基因與細(xì)胞運動和細(xì)胞外基質(zhì)分解有關(guān)，暗示了它的侵入性（圖2E）。TSKs表達經(jīng)典的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物，如VIM和ITGA5(圖2F)；但是EMT類似的TSK細(xì)胞缺乏經(jīng)典表達EMT轉(zhuǎn)錄因子(圖2H)。因此，我們通過單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行推理和聚類，提名AP1和ETS家族成員為潛在控制TSKs的TFs(圖2I)。TSK細(xì)胞也表現(xiàn)出較大的EMT評分范圍，提示細(xì)胞狀態(tài)具備高可塑性(圖2G)，與EMT連續(xù)模型一致。基底細(xì)胞（Basal）在腫瘤中的發(fā)生率約是正常循環(huán)細(xì)胞的四倍(圖2K)?？偟膩碚f，cSCC表現(xiàn)出分化失常，基底細(xì)胞迅速增殖，并出現(xiàn)表達EMT連鎖基因的TSK亞群。

圖2|腫瘤角質(zhì)細(xì)胞的異常分化層次

三、?空間轉(zhuǎn)錄組確定了TSK-Basal的組織前沿異質(zhì)性

在患者中，腫瘤相關(guān)的斑點簇展現(xiàn)出單細(xì)胞測序腫瘤KCs的定位基因表達，同時免疫或間質(zhì)基因與腫瘤臨近間質(zhì)、未受累的間質(zhì)或附件區(qū)域有關(guān)聯(lián)，與大體的cSCC結(jié)構(gòu)一致（圖3A）。使用scRNA-seq中TSK標(biāo)記基因?qū)γ總€空間轉(zhuǎn)錄組斑點評分，顯著突出了一個TSK-high簇，包括TSK標(biāo)記物MMP10（圖3B&C）。在具有清晰前沿的腫瘤中，TSK鄰近間質(zhì)富集了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF)和內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本，表明TSK細(xì)胞主要位于纖維血管微環(huán)境中(圖3D)。超過80%的TSK高簇點位于腫瘤前沿，其余的前沿點富集了Basal腫瘤基因(圖3E&F)，這種共存關(guān)系通過共表達標(biāo)志物COL17A1的免疫組化得到進一步確認(rèn)（圖3G&H）。此外，炎癥反應(yīng)和干擾素信號基因在非TSK前沿表達，與干擾素相關(guān)轉(zhuǎn)錄本在腫瘤基底群體中的存在一致(圖2E&I)。這些結(jié)果確定了TSK、Basal細(xì)胞以及TSK近端纖維血管生態(tài)位造成的cSCC腫瘤前沿的異質(zhì)性。

圖3|空間轉(zhuǎn)錄組反映了前沿異質(zhì)性

四、?cSCC的免疫景象

圖4|cSCC的免疫景象

五、?炎癥下TME的單細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)

利用多重離子束成像（MIBI）技術(shù)，在單細(xì)胞分辨率下解析TME的空間組織。我們對6例患者的腫瘤前緣進行了18個視野的MIBI掃描，對38個腫瘤和基質(zhì)/免疫蛋白標(biāo)志物圖像進行分段，確定了55832個細(xì)胞(圖5A)，并且聚類分析的主要細(xì)胞類型與scRNA-seq細(xì)胞類型相似（圖5B）。間質(zhì)和免疫組分在腫瘤內(nèi)和腫瘤間是可變的，12/17的腫瘤患者圖像聚類不一致(圖5C)。腫瘤內(nèi)外的CD8 T細(xì)胞、Tregs、巨噬細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞存在高度相關(guān)性，尤其前兩者更甚(圖5D)。5/12視野具備足夠的細(xì)胞進行系統(tǒng)分析CD8 T細(xì)胞和Tregs距離(圖5F-H)，我們發(fā)現(xiàn)了兩者的共定位，并且CD8 T細(xì)胞的比例也與共定位呈正相關(guān)，表明Tregs受到TME的共招募和CD8 T細(xì)胞的共定位共同調(diào)節(jié)，另外CD4 T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與Tregs共定位(圖5I)。成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Tregs在腫瘤-間質(zhì)邊緣最豐富，而CD8 T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞被大量排除在腫瘤之外，表明 Treg 定位可能阻止效應(yīng)淋巴細(xì)胞進入腫瘤(圖5J&K)。已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)免疫抑制或抗腫瘤活性B細(xì)胞是唯一表現(xiàn)出優(yōu)先浸潤的細(xì)胞類型。

圖5|cSCC中淋巴細(xì)胞子集的空間結(jié)構(gòu)

六、?映射前沿生態(tài)位的細(xì)胞串?dāng)_

進一步，我們整合scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)來描述前沿鄰近腫瘤和TME細(xì)胞之間的信號通路(圖6A)?；谂潴w-受體對數(shù)據(jù)庫，TSKs廣參與了自分泌和旁分泌相互作用(主要與CAFs、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和MDSCs)(圖6B&C)。我們使用NicheNet和ST對前沿預(yù)測為調(diào)節(jié)TME特異性細(xì)胞類型標(biāo)記的腫瘤KC配體進行優(yōu)先排序。與TSK-纖維血管生態(tài)位一致的是，對CAFs的顯著TSK信號通路是由幾對TSK-CAF配體-受體對介導(dǎo)的，包括MMP9-LRP1和TNC-SDC1(圖6D&E)。此外，TSKs可通過配體-受體對（PGF-FLT1、PGF-NRP2和EFNB1-EPHB4）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞。相反地，內(nèi)皮細(xì)胞和CAFs顯著共表達NicheNet預(yù)測配體，如TFPI, FN1，和THBS1，這些與TSK受體匹配(圖6F&G)。進一步證實TSKs是一種類似EMT的群體。為了判定TSK細(xì)胞是否與多變的TME普遍關(guān)聯(lián)，我們調(diào)研了TCGA數(shù)據(jù)庫中31種實體瘤數(shù)千個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。我們進一步判定TSK配體是否誘導(dǎo)CAF基因（1）伴隨配體CNV缺失，減少CAF基因表達；(2)配體表達和CAF基因的關(guān)聯(lián)(圖6H)，這個在過往研究中被證實。另外TSK細(xì)胞可以抑制抗腫瘤免疫。雖然這些研究還不明確TSK細(xì)胞是內(nèi)在抵抗還是免疫調(diào)節(jié)活性起作用，但這個亞群提供了一個提高免疫治療的目標(biāo)方向。

圖6|與前沿生態(tài)位相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞串?dāng)_情景

七、?異種移植再現(xiàn)自發(fā)性人cSCC的細(xì)胞亞群

使用典型的小鼠模型進行腫瘤亞群功能評估，單細(xì)胞測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)異種移植SCC細(xì)胞的特征與患者樣本基本一致（圖7A-C）。來自患者和異種移植數(shù)據(jù)類似TME細(xì)胞類型的比較也顯示，人和小鼠之間共享標(biāo)記物高度重疊，只有異種移植的少量脊髓細(xì)胞存在微妙差異(圖7D&E)。使用患者腫瘤亞群標(biāo)志物對體外培養(yǎng)的SCC細(xì)胞系進行分析，發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞在基底、循環(huán)和TSK評分方面表現(xiàn)出較小的異質(zhì)性，這也反映了TME是一個腫瘤細(xì)胞群出現(xiàn)的條件(圖7F)。綜上，異種移植模型概括了cSCC ITH的關(guān)鍵特征。

圖7|腫瘤角化細(xì)胞缺陷的體內(nèi)CRISPR分析

八、?體內(nèi)腫瘤KC亞群基因的CRISPR篩選

接下來，使用CRISPR/Cas9技術(shù)對3個鱗狀細(xì)胞癌移植瘤株進行篩選（4個亞群，334個富集基因），評估腫瘤KC亞群的功能作用(圖7A)。通過STARS算法，獲得38個命中點，其中18個至少被兩種細(xì)胞系共享(圖7F)。特別的，對腫瘤生長重要的基因偏向于在TSK、基底和循環(huán)細(xì)胞中表達。腫瘤循環(huán)KCs特有的參與細(xì)胞循環(huán)的基因形成了以PCNA和GINS2為中心的最大網(wǎng)絡(luò)。最大的TSK特異性網(wǎng)絡(luò)包括ITGB1、FERMT1、CD151、ARPC2、HSP90B1。ITGB1、CD151和 FERMT1的蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞表面相互作用，介導(dǎo)整合素信號。通過體外實驗驗證ITGB1、FERMT1和CD151對腫瘤生長的重要性低于體內(nèi)，證實了如果整合素信號介導(dǎo)與TME的通訊，相關(guān)基因在體內(nèi)腫瘤發(fā)生中應(yīng)該比在體外有更大的依賴性的推斷。綜上，體內(nèi)異種移植篩查結(jié)合TCGA分析突出了可能控制亞群特異性致瘤功能的關(guān)鍵基因。

文章總結(jié)

本文整合單細(xì)胞RNA測序、空間轉(zhuǎn)錄組和多路離子束成像繪制了人類鱗狀細(xì)胞癌組成和空間結(jié)構(gòu)的多模式圖譜，發(fā)現(xiàn)了一個定位于腫瘤前沿的腫瘤特異性角化細(xì)胞（TSKs）。TSK在腫瘤微環(huán)境的機制探索，體內(nèi)CRISPR篩選確定的腫瘤亞群致瘤基因網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤和免疫動力學(xué)研究提供了極大支持。