研究背景

La相關(guān)蛋白（La-related proteins，LARP）是與癌癥相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白（由LARP 1、1B、3、4A、4B、6和7組成）的進(jìn)化保守家族。LARP1具有致癌性，且腫瘤組織較高水平的LARP1蛋白與卵巢癌、大腸癌和前列腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。LARP1 包含兩個(gè) RNA 結(jié)合域，一個(gè)保守的La module，由La domain 和一個(gè)臨近的RNA 識別基序 (RNA recognition motif，RRM) 組成的RNA結(jié)合域，和一個(gè)C端“ DM15結(jié)構(gòu)域”。LARP1與poly-A結(jié)合蛋白（poly-A binding protein，PABP）形成復(fù)合物，與超過3000個(gè)mRNA結(jié)合，包括5?TOP-motif轉(zhuǎn)錄本，已知此類轉(zhuǎn)錄本可編碼核糖體機(jī)器。據(jù)估計(jì)，人類基因組僅包含19,000–21,000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，但合成了70,000多種蛋白質(zhì)，這可以通過pre-mRNA的選擇性剪接/可變剪接加工產(chǎn)生多個(gè)成熟的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)本來解釋。因此，每個(gè)基因具有編碼多種蛋白質(zhì)同工型(isoform)的潛力，這種機(jī)制增加了蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性。然而，基因通常僅主要表達(dá)一種蛋白質(zhì)，表明加工并釋放到細(xì)胞質(zhì)中的mRNA經(jīng)過選擇或“審查”過程。

使用LARP1各個(gè)區(qū)域的抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡WB實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了大約150/130kDa的雙鏈帶，這被解釋為代表了2種LARP1亞型。為了探索這一點(diǎn)，作者系統(tǒng)地進(jìn)行了一系列計(jì)算機(jī)、轉(zhuǎn)錄組、生化和細(xì)胞分析，以闡明LARP1在癌癥和正常細(xì)胞中的真實(shí)表達(dá)情況。

技術(shù)方法

1、公共polyA方式建庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析LARP1 isoform表達(dá)譜：測序數(shù)據(jù)特異比對到長LARP1同工型的外顯子1，沒有reads比對到SI-LARP1的外顯子1；

2、Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-direct）繪制LARP家族基因isoform landscape：2種細(xì)胞系，人HEK-293 T和OVCAR-8；每個(gè)樣本約1.7-2Mb 長reads，約2G數(shù)據(jù)量；LARP3表達(dá)最高，LI-LARP1被鑒定為主要表達(dá)的LARP1亞型；

3、特異性引物擴(kuò)增及sanger測序驗(yàn)證SI-LARP1和LI-LARP1 isoform表達(dá)情況：501-MEL(黑色素瘤細(xì)胞系)和OVCAR-8細(xì)胞中只表達(dá)LI-LARP1；

4、NCI-60幾種癌細(xì)胞系隨機(jī)引物及oligo dT反轉(zhuǎn)錄qPCR驗(yàn)證SI-LARP1和LI-LARP1 isoform表達(dá)：長LARP1 isoform（LI-LARP1）在廣泛的癌癥和正常細(xì)胞中是主要表達(dá)的形式，而SI-LARP1 mRNA（如果表達(dá)的話）以低水平和不成熟的形式存在。

5、isoform特異性多肽檢測：凝膠遷移實(shí)驗(yàn)觀察2種isoform與內(nèi)源性LARP1遷移模式；體外過表達(dá)及pull down實(shí)驗(yàn)鑒定2種isoform特異性多肽；免疫沉淀-質(zhì)譜分析內(nèi)源性LARP1中2種isoform特異性多肽占比；

6、短isoform表達(dá)抑制的調(diào)控機(jī)制分析：公共數(shù)據(jù)庫中DNA甲基化數(shù)據(jù)以及H3K27ac chip-seq數(shù)據(jù)分析可能的表觀調(diào)控機(jī)制；DNA甲基化酶抑制劑5-氮胞苷處理檢測SI-LARP1 mRNA和蛋白表達(dá)；siRNA特異性敲除2種isoform分析各自表達(dá)改變對于細(xì)胞活性和凋亡的影響；pull down實(shí)驗(yàn)分析與PABP（poly A結(jié)合蛋白）的結(jié)合互作；TSS區(qū)保守性分析2種isoform可能的功能差異；

研究結(jié)果

1、LARP1在癌細(xì)胞中的isoform landscape

圖1A為NCBI基因數(shù)據(jù)庫中列出的9種不同的LARP1經(jīng)驗(yàn)證的isoform。LARP1典型轉(zhuǎn)錄本為NM_015315.5，編碼1019個(gè)氨基酸（NP_056130.2）的蛋白質(zhì)，在此處稱為“ SI-LARP1”。UniProtKB數(shù)據(jù)庫引用了另一個(gè)比較長的轉(zhuǎn)錄本NM_033551.3作為LARP1的規(guī)范形式，它對應(yīng)于1096個(gè)氨基酸蛋白（NP_291029.2），在此稱為“LI-LARP1” 。SI-LARP1蛋白與LI-LARP1不同，它缺少前77個(gè)氨基酸，并且氨基酸M1至N67不同。

圖1

二代短reads polyA轉(zhuǎn)錄組公共數(shù)據(jù)分析：為了研究LARP1在細(xì)胞中的表達(dá)譜，作者使用了可公開獲得的RNA測序數(shù)據(jù)集。共計(jì)從198個(gè)組織、128個(gè)細(xì)胞系和54個(gè)原代細(xì)胞系中提取了371個(gè)包含poly-(A)的RNA測序數(shù)據(jù)集，并將其reads與包含所有預(yù)測的LARP1 isoform的hg38：Chr5 154700000至154850000染色體區(qū)域比對(圖2A)。首先關(guān)注測序reads與第一個(gè)外顯子的比對，兩個(gè)LARP1亞型不同的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)測序數(shù)據(jù)特異比對到長LARP1同工型的外顯子1，沒有reads比對到SI-LARP1的外顯子1。2個(gè)isoform間共享的第2-19號外顯子已完全被測序數(shù)據(jù)所覆蓋。

圖2A

Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序：為了進(jìn)一步了解LARP1 isoform的表達(dá)，在HEK-293 T和OVCAR-8細(xì)胞(永生化的人類胚胎腎細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系)中分別進(jìn)行了牛津納米孔測序技術(shù)（ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序）(圖2B-D)。這種RNA直接測序技術(shù)可以檢測長讀長轉(zhuǎn)錄本isoform，并可以無PCR偏倚地定量轉(zhuǎn)錄本豐度。與人類基因組（Hg38）比對，并使用IGV可視化。在HEK-293T細(xì)胞中，檢測到總共2,038,842個(gè)轉(zhuǎn)錄本，而在OVCAR-8細(xì)胞的樣品中僅檢測到1,834,870個(gè)轉(zhuǎn)錄本。(根據(jù)百邁客的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)大概每個(gè)樣本2G多的數(shù)據(jù)量)作者對所有比對到7個(gè)LARP家族成員的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)定量，校正各樣本數(shù)據(jù)量差異將其標(biāo)準(zhǔn)化為TPM(transcripts per million，每百萬轉(zhuǎn)錄本)（圖2B）。在LARP家族成員中，LARP3的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量最高(TPM=194)。相反，其他LARPs的表達(dá)值TPM遠(yuǎn)低于50，其中LARP1B和LARP4B的表達(dá)最低。且與前人研究一致，致癌性LARP1在OVCAR-8癌細(xì)胞(TPM 52)中的表達(dá)水平高于HEK-293 T細(xì)胞(TPM 38)中的表達(dá)水平。為了分析LARP1 sioform在這些細(xì)胞中的表達(dá)，作者使用Sashima圖（圖2C）可視化剪接位點(diǎn)。使用這種RNA直接測序的nanopore全長轉(zhuǎn)錄組方法，在2個(gè)測試的細(xì)胞系中均未檢測到SI-LARP1。盡管LARPs的表達(dá)水平低于其他基因，例如GAPDH（在OVCAR-8細(xì)胞中TPM高達(dá)6396），因此LI-LARP1被鑒定為主要表達(dá)的LARP1亞型。作者還觀察到5′截短的LARP1轉(zhuǎn)錄本積累，LARP1B的3種isoform共表達(dá)（NM-018078，NM_178043，NM-032239），LARP6的2種isoform共表達(dá)（NM_197958，NM_018357）（圖2D）。對于其他LARP，能夠確認(rèn)ONT測序檢測到的主要轉(zhuǎn)錄本與經(jīng)典isoform相對應(yīng)。

圖2 B-D

特異性引物擴(kuò)增及sanger測序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：為了驗(yàn)證ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)的LI-LARP1是主要isoform，作者設(shè)計(jì)了2對特異性引物，以通過PCR檢測短或長LARP1 isoform或2種總和（使用保守的exon 7上的引物，此處稱為“總LARP1”）（圖3）。設(shè)計(jì)對應(yīng)于每個(gè)LARP1 isoform外顯子1的正向引物和下游外顯子的外顯子連接處的反向引物。這些引物有效性通過重組SI-LARP1或LI-LARP1表達(dá)后的成功擴(kuò)增得到證實(shí)。設(shè)計(jì)用于檢測總LARP1的引物，以在所有預(yù)測的isoform共有的第7外顯子上退火。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LI-LARP1在501-MEL(黑色素瘤細(xì)胞系)和OVCAR-8細(xì)胞中表達(dá)，但未檢測到SI-LARP1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3A）。對所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序以驗(yàn)證所需的擴(kuò)增子。接下來，設(shè)計(jì)了對長LARP1 isoform(LI-LARP1)的開放閱讀框具有特異性的引物，并通過cDNA文庫中的PCR進(jìn)行了擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的sanger測序結(jié)果揭示了LI-LARP1預(yù)測的完整核苷酸序列，包括其特定的外顯子1（圖3B）。值得注意的是，所有試圖擴(kuò)增SI LARP1 isoform編碼序列的嘗試均告以失敗，表明該isoform在得到的cDNA文庫中不存在。

圖3上 S1 / S2和L1 / L2分別代表檢測SI-LARP1或LI-LARP1的引物對。T代表使用組成性表達(dá)的外顯子7退火的引物對檢測到的總RNA。HK代表管家基因OAZ1。

2、長LARP1 isoform在NCI-60癌癥細(xì)胞系中占主導(dǎo)地位

為了確定LI-LARP1是否在更廣泛的癌細(xì)胞系中表達(dá)，作者用qRT-PCR檢測了NCI-60癌細(xì)胞系(美國國立癌癥研究(NCI)規(guī)定的60種用于藥物篩選的癌細(xì)胞系，包括黑素瘤、腎癌、卵巢癌、腦癌、白血球增多癥、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌細(xì)胞系)（圖3C）。盡管樣品之間LI-LARP1的表達(dá)差異高達(dá)37倍，但在所有細(xì)胞系中均可檢測到。然而，所有系中SI-LARP1表達(dá)均低于檢測閾值（cT值<35）。并測量NCI的5種癌細(xì)胞系（MCF-7、OVCAR-8、SK-OV-3、501-MEL和HEK-293T）中的SI和LI-LARP1表達(dá)驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)（圖3D）。在所有五個(gè)細(xì)胞系中，LI LARP1的水平至少比SI-LARP1高1000倍。由于SI-LARP1的表達(dá)水平接近或低于檢測極限，因此作者探討了其余檢測到的轉(zhuǎn)錄本是否為人工產(chǎn)物。成熟的mRNA的標(biāo)志是存在3?poly-（A）尾，這是其核輸出所必需的。從OVCAR-8、SK-OV-3、501-MEL和HEK-293T中提取的總RNA使用隨機(jī)或寡聚（dT）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（圖3E）。隨著隨機(jī)引物與RNA庫中任何類型的轉(zhuǎn)錄本退火，PCR擴(kuò)增還將檢測未加工完成的mRNA種類。相反，寡聚（dT）引物導(dǎo)致多聚腺苷酸化(帶polyA)的mRNA發(fā)生特定的逆轉(zhuǎn)錄。使用基因特異性引物測量2個(gè)cDNA文庫中SI-和LI-LARP1 isoform的水平。將表達(dá)水平使用管家基因OAZ1標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算相對表達(dá)量。作者發(fā)現(xiàn)完全加工和多聚腺苷酸化的SI-LARP1 mRNA的水平低于檢測極限，表明SI-LARP1 mRNA表達(dá)但未完全加工成成熟的聚腺苷酸化的mRNA。

圖3下? C中每根柱子上深灰色代表SI-LARP1，其他顏色代表LI-LARP1。

總之，長LARP1 isoform（LI-LARP1）在廣泛的癌癥和正常細(xì)胞中是主要表達(dá)的形式，而SI-LARP1 mRNA（如果表達(dá)的話）以低水平和不成熟的形式存在。

3、在4種不同的人類細(xì)胞系中鑒定長isoform特異性多肽

如前所述，SI-和LI-LARP1具有由不同外顯子1序列編碼的獨(dú)特N末端（圖4A）。2個(gè)外顯子均在框內(nèi)終止，因此外顯子選擇不影響LARP1的下游閱讀框和氨基酸組成。較長的isoform多了77個(gè)氨基酸長的多肽鏈，并導(dǎo)致預(yù)測的蛋白質(zhì)比短isoform大8.4 kDa。當(dāng)2種形式都被外源表達(dá)時(shí)，在SDS凝膠電泳時(shí)僅觀察到遷移模式的微小差異（圖4B）。比較外源表達(dá)的SI-LARP1和LI-LARP1與內(nèi)源性LARP1的凝膠遷移模式，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性LARP1與LI-LARP1共遷移，表明LI-LARP1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物占主導(dǎo)地位。

圖4 A-B

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，首先，在OVCAR-8細(xì)胞中異位表達(dá)了2種LARP1 isoform，并使用針對共表達(dá)的Xpress標(biāo)簽的抗體從粗蛋白裂解物中免疫沉淀富集LARP1蛋白（圖4C）–pull down實(shí)驗(yàn)。隨后，使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶對樣品進(jìn)行溶液消化后，Shotgun LC MS/MS質(zhì)譜分析以鑒定對應(yīng)于SI-或LI-LARP1 isoform的N端特異性肽段。鑒定了從序列位置45和46產(chǎn)生的3種肽（質(zhì)量為N46SVALAAAPR：485.2773 Th（m/z）; K45NpSVALAAAPR：549.3257 Th（m/z）; K45NSAVALAAAPR：589,3085 Th（m/z ））作為SI-LARP1的唯一特征（圖4D）。相反，對于LI-LARP1，鑒定了由與外顯子1對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列產(chǎn)生的152個(gè)肽。第二步，免疫沉淀富集OVCAR-8、501-MEL、SK-OV-3和HEK-293T細(xì)胞的內(nèi)源LARP1，并進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用監(jiān)督自動(dòng)算法檢測預(yù)先指定的isofrom特異性肽（圖4E-F）。LARP1的肽覆蓋率范圍為內(nèi)源性免疫沉淀蛋白的24-44％。盡管在所有4個(gè)細(xì)胞系中都鑒定出了與LI-LARP1 N端相對應(yīng)的獨(dú)特肽，但我們無法在任何樣品中鑒定出對SI-LARP1亞型具有特異性的任何肽。這些結(jié)果與觀察到的不存在對應(yīng)于SI-LARP1的mRNA相一致。

圖4 C-F

4、短isoform啟動(dòng)子區(qū)被高甲基化而啟動(dòng)子活性被抑制

接下來，作者研究了調(diào)節(jié)SI-LARP1表達(dá)的機(jī)制。轉(zhuǎn)錄活性與染色質(zhì)狀態(tài)相關(guān)，其特征在于組蛋白修飾、開放染色質(zhì)和特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。因此，作者使用了3個(gè)公開可用的數(shù)據(jù)集來預(yù)測短和長LARP1 isoform的啟動(dòng)子活性（圖5A）。SI-LARP1的預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS位于GRCh38.p13：154,712,843，而LI-LARP1的TSS處于SI-LARP1的第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，位置為GRCh38.p13：154,755,377。基于3個(gè)參數(shù)來判斷轉(zhuǎn)錄活性：首先，使用ChIP-seq數(shù)據(jù)來識別H3K27ac標(biāo)記，該標(biāo)記代表H3組蛋白的賴氨酸27的乙?；?，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)；其次，使用來自人類甲基化芯片的數(shù)據(jù)來鑒定CpG甲基化，其與基因沉默相關(guān)，反之，它們的去甲基化激活基因表達(dá)；第三，使用多變量隱馬爾可夫模型（HMM）整合ChIP-seq數(shù)據(jù)，預(yù)測了9種人類細(xì)胞系的區(qū)段化染色質(zhì)狀態(tài)。所有數(shù)據(jù)均與GRCh37/hg19進(jìn)行比對，并使用UCSC基因組瀏覽器進(jìn)行分析（圖5A）。作者發(fā)現(xiàn)SI LARP1 TSS區(qū)的CpG甲基化水平較高，但H3K27AC標(biāo)記較低，表明啟動(dòng)子活性降低。相反，LI-LARP1 TSS區(qū)的CpG甲基化水平較低，而H3K27AC標(biāo)記較高，表明存在一個(gè)活躍的啟動(dòng)子位點(diǎn)。對于SI-LARP1而言，在人類胚胎干細(xì)胞中觀察到啟動(dòng)子活性的唯一顯著增加?？傮w而言，LI-LARP1的啟動(dòng)子區(qū)域處于開放的染色質(zhì)狀態(tài)，這表明該區(qū)域具有較高的啟動(dòng)子活性，而SI-LARP的啟動(dòng)子受到表觀遺傳抑制。

圖5 A-B

為證實(shí)CpG甲基化對SI-LARP1啟動(dòng)子的抑制作用，使用5-氮胞苷(5-Aza，胞苷的化學(xué)類似物，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)通過去甲基化來重新激活其表達(dá)（圖5B）。為此，將SK-OV-3、OVCAR-8、501-MEL和HEK-293T細(xì)胞用濃度遞增的5-Aza處理3天或5天。為了確認(rèn)SI-LARP1表達(dá)的重新激活，定量PCR測量了處理過的細(xì)胞和對照細(xì)胞中SI-LARP1 mRNA的水平（圖5B），并觀察到3天后SI-LARP1的濃度依賴性增加了5倍。使用最佳濃度并延長孵育時(shí)間至5天時(shí)，發(fā)現(xiàn)OVCAR-8中的SI-LARP1 mRNA增加了20倍。但是，蛋白質(zhì)印跡法沒有檢測到任何與SI-LARP1相對應(yīng)的蛋白質(zhì)。值得注意的是，沒有觀察到LI-LARP1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，SI-LARP1的表達(dá)在某種程度上受到表觀遺傳調(diào)控。但是，即使在表觀遺傳學(xué)上解除抑制，SI-LARP1也不會通過細(xì)胞質(zhì)翻譯機(jī)制合成為蛋白質(zhì)。

接下來，作者探討了LI-LARP1的表達(dá)模式是否與SI-LARP1和內(nèi)源性LARP1的表達(dá)模式相似。Hopkins等人的先前工作表明，在OVCAR-8和SK-OV-3細(xì)胞中使用能夠同時(shí)靶向SI-LARP1和LI-LARP1的siRNA瞬時(shí)敲低LARP1與細(xì)胞活力降低和凋亡增加有關(guān)。為了驗(yàn)證該觀察結(jié)果可歸因于LI-LARP1，設(shè)計(jì)了2種siRNA：靶向LI-LARP1 mRNA獨(dú)特的外顯子1或2種isoform普遍存在的外顯子13。與對照scramble siRNA處理的OVCAR-8細(xì)胞相比，2種siRNA均導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。使用針對外顯子13的siRNA可以成功消除了LARP1蛋白質(zhì)印跡雙鏈體中較低的蛋白帶（其大小約為130 kDa），這表明該條帶對應(yīng)于LARP1的未知的N端截短的變體。

此外，已充分確定的是，LARP1與PABP（poly A結(jié)合蛋白）相互作用，使靶mRNA的5’和3’UTR緊密相鄰。為了證明LI-LARP1可與PABP互作，作者對內(nèi)源性和異位表達(dá)的LARP1進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SI-LARP1和LI-LARP1都能夠結(jié)合PABP。

圖5 C

接下來，作者對SI-LARP1是否可以發(fā)揮獨(dú)特的功能作用感興趣。為此分析了2種LARP1亞型的TSS區(qū)保守水平（圖5C）。作者假設(shè)，進(jìn)化保守將暗示選擇性壓力，因此每種亞型的作用不同。為了解釋LARP1亞型的進(jìn)化保守性，使用UCSC基因組瀏覽器在脊椎動(dòng)物（鳥類、魚類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物）亞門上生成了100個(gè)可用LARP1序列的多序列比對。出乎意料的是，LI-LARP1外顯子1在整個(gè)亞科中都具有很強(qiáng)的保守性，但SI-LARP1外顯子1的保守性僅存在于胎盤動(dòng)物分支中，其中包括人類和其他靈長類動(dòng)物。這表明它可能在胎盤哺乳動(dòng)物的進(jìn)化晚期獲得了功能性作用。相比之下，LI-LARP1的保守性跨多個(gè)進(jìn)化分支表明作用更為古老。

小結(jié)

作者先前發(fā)表的研究預(yù)測了LARP1的10個(gè)潛在替代啟動(dòng)子，并且與大多數(shù)編碼基因具有多種isoform但只有一種表達(dá)的蛋白的證據(jù)相符。盡管表達(dá)的isoform的進(jìn)化保守表明其具有保守的生物學(xué)功能，但未表達(dá)的isoform的作用仍存在爭議。盡管有些人假設(shè)它們是轉(zhuǎn)錄噪聲，但另一些人則認(rèn)為需要它們調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能、相互作用或定位或生成進(jìn)化試驗(yàn)場允許功能和結(jié)構(gòu)域進(jìn)化的。確實(shí)，本研究表明SI-LARP1的外顯子1在胎盤哺乳動(dòng)物小分支中是高度保守的，這表明它提供了不同于LI-LARP1的功能性和進(jìn)化優(yōu)勢。此外，僅在人類胚胎干細(xì)胞中檢測到SI-LARP1 mRNA可能表明在胚胎發(fā)育中起作用。SI-LARP1和亞細(xì)胞定位的確切作用需要在未來的研究中解決。

參考文獻(xiàn)

Schwenzer H, Abdel Mouti M, Neubert P, et al. LARP1 isoform expression in human cancer cell lines [published online ahead of print, 2020 Apr 14]. RNA Biol. 2020;1‐11. doi:10.1080/15476286.2020.1744320